三七叶皂苷上层析柱的操作步骤，柱层析怎么显色在什么时候加入显色剂

发布时间：2023-06-13 03:50 编辑：网络点击：219

本文目录一览柱层析怎么显色在什么时候加入显色剂2，柱层析的基本操作过程3，植物多酚柱层析纯化方法中关键操作是什么4，皂苷的检测方法5，吸附柱层析法吸附柱怎么做6，做柱层析时装柱子的过程是怎样的7，怎样装层析柱才不会有气泡8，请问一下亲和……

本文目录一览

1，柱层析怎么显色在什么时候加入显色剂
2，柱层析的基本操作过程
3，植物多酚柱层析纯化方法中关键操作是什么
4，皂苷的检测方法
5，吸附柱层析法吸附柱怎么做
6，做柱层析时装柱子的过程是怎样的
7，怎样装层析柱才不会有气泡
8，请问一下亲和层析的操作要点是什么啊
9，层析法的主要操作

1，柱层析怎么显色在什么时候加入显色剂

高锰酸钾、紫外、DNP、浓硫酸等是常用的方法

三七叶皂苷上层析柱的操作步骤

2，柱层析的基本操作过程

柱层析的基本操作过程：主要包括常压分离、减压分离和加压分离 3种模式。常压分离是最简单的分离模式方便、简单 ,但是洗脱时间长。减压分离尽管能节省填料的使用量，但是由于大量的空气通过填料会使溶剂挥发，并且有时在柱子外面会有水汽凝结，以及有些易分解的化合物也难以得到，而且还必须同时使用水泵或真空泵抽气。加压分离可以加快淋洗剂的流动速度，缩短样品的洗脱时间，是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗液更快洗脱。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵等。柱层析技术也称柱色谱技术。一根柱子里先填充不溶性基质形成固定相，将混合样品加到柱子上后用特别的溶剂洗脱，溶剂组成流动相。在样品从柱子上洗脱下来的过程中，根据混合物中各组分在固定向和流动相中的分配系数不同经过多次反复分配，将不同组分逐一分离。根据填充基质和样品分配交换原理不同，离子交换层析，凝胶过滤层析和亲和层析是三种分离混合物的经典层析技术。

三七叶皂苷上层析柱的操作步骤

3，植物多酚柱层析纯化方法中关键操作是什么

湿法装柱。液面高度要是低于液床高度，或是过松过紧，有气泡，有断节，都会对实验后续产生很大的影响。其实哪一步操作没做好后边都不能成功了，这步相对而言重要。

支持一下感觉挺不错的

三七叶皂苷上层析柱的操作步骤

4，皂苷的检测方法

本方法适用于功能性食品中总皂苷的测定　　本方法人参皂苷Re的低检出量为2μg/mL　　一、方法提要　　样品中总皂苷经提取、PT—大孔吸附树脂柱预分离后，在酸性条件下，香草醛与人参皂苷生成有色化合物，以人参皂苷Re为对照品，于560nm处比色测定。　　二、仪器　　1.722分光光度计。　　2.PT—大孔吸附树脂柱(河北省津杨滤材厂)。　　3.超声波振荡器。　　三、试剂　　1.甲醇(分析纯)　　2.乙醇(分析纯)　　3.人参皂苷Re标准品(中国药品生物制品检定所)　　4.5%香草醛溶液：称取5g香草醛，加冰乙酸溶解并定容至l00mL　　5.高氯酸(分析纯)　　6.冰乙酸(分析纯)　　7.人参皂苷Re标准溶液：称取人参皂苷Re标准品20.0mg，用甲醇溶解并定容至10mL，即每1mL含人参皂苷Re2.0mg　　8.重蒸水　　四、测定步骤　　1.样品处理：　　(1)固体样品　　称取1.0g左右样品于100mL烧杯中，加入20～40mL 85%乙醇，超声波振荡30min，再定容至50mL，摇匀，放置，吸取上清液1.0mL挥干后以水溶解残渣，进行柱分离　　(2)液体样品　　含乙醇的酒类样品：准确吸取1.0mL样品放于蒸发皿中，蒸干，用水溶解残渣，用此液进行柱层析；非乙醇类液体样品：准确吸取1.0mL样品(如浓度高或颜色深，需稀释一定体积后再取1.0mL)直接进行柱分离　　2.柱层析　　以PT—大孔吸附树脂柱进行层析分离，准确吸取上述已处理好的样品溶液1.0mL上柱，用15mL水洗柱，以洗去糖分等水溶性杂质，弃去洗脱液，再用20mL85%乙醇洗脱总皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中，于水浴上蒸干，以此作显色用

5，吸附柱层析法吸附柱怎么做

将需层析的物料和层析填料按照比例拌匀上柱，上柱时填料一定要装实，不能有空气气泡或其他间隙。

将固定相用溶剂浸泡后灌入柱内，柱下端有一个阀门，将溶剂放至比固定相表面高1-2公分即可。

6，做柱层析时装柱子的过程是怎样的

把柱子压干，或者如果你不着急用的话可以将柱子先放一段时间，等硅胶干了以后将硅胶倒出来就好了。可以用水洗下，也可以不洗，除非里面粘了什么东西。下次再用的时候用乙醇洗洗然后吹干就好了。层析住还是蛮好处理的。

装柱方法分为湿法和干法，一般来说，湿法装柱的效果优于干法装柱。湿法装柱：先将柱层析的填料活化处理后浸润在适宜的有机溶剂中，使之处于有机环境。装柱时在层析柱自下而上依次填入硅烷花玻璃棉→石英砂→已处理好的层析填料，一边装柱一边用洗耳球轻轻敲打，使填料紧实，然后打开旋塞放掉多余的有机溶剂即可进行样品分析。干法装柱：现在层析柱内填入硅烷花玻璃棉，然后用不同极性的有机溶剂对层析柱的内壁进行充分润洗，待层析柱晾干，依次填入石英砂及各种层析填料，同样，一边装柱一边用洗耳球轻轻敲打，使填料紧实，然后加入一定量的有机溶剂淋洗填好的柱子，一般这个体积为柱子死体积的2倍。然后打开旋塞使淋洗液流出，即可进行样品分析。填料紧实是保证层析柱柱效的关键，一定要注意。层析柱最下层的棉花，我们一般是用硅烷花玻璃棉的，在马弗炉中活化即可用。如果用脱脂棉，需要用二氯甲烷抽提3遍以去除杂质，以防干扰实验。

加填料的时候要轻轻敲打柱子这样柱子能装的比较实柱子装不实的话可能就白过了

7，怎样装层析柱才不会有气泡

要是已经上样了，建议还是冲柱，要是重装柱子，浪费人力物力！

我干柱和湿柱都装过的，没有你说的那么多气泡的。教教你吧。层析柱有很多种的。不知道你的层析柱是多大的啊，还有时硅胶层析柱吗？其实，不管是干柱和湿柱，不都要加层析液吗？你不能要求它一开始就没有气泡的。要用洗脱剂不停的洗脱，怎么说呢，就是用你配置好的试剂一边一边对柱子进行洗脱（这是关键，也是装柱的必要步骤地），这样不但可以消除气泡，还可以使硅胶充分沉降，让层析效果更好。等柱子没有气泡后在上样用洗脱液进行层析。还有，提醒一下，不知道你的柱子有多大，如果大的话，比如我用过的那种高2米，直径大约10厘米的柱子的话，你就不能心急了，光我刚说的那第一步就要1个多星期才能好，才能上样，层析。但如果柱子不大的话，比如半米来长的小柱子的话，那就好多了，一般沉降个大半天就能上样了。具体情况自己看了。不知道能帮你不，如果还有什么关于层析柱的问题你也可以直接问我啊，我会尽量帮你的。

干法装柱确实容易产生气泡，装完柱后用吸耳球吸耳球敲打柱壁会赶走气泡，但要有耐心，要将硅胶完全压实才会没有气泡。最好的办法是将柱子底部与真空泵相连，打开真空泵将气体抽出，这样装的柱子气泡很少。湿法装柱要注意在装柱之前要赶走气泡，可以用玻棒搅拌至无气泡；也可以用超声波赶走气泡，一般将硅胶或其他载体装入烧杯中，加入平衡液，放入超声波清洗仪中超声10-15分钟，然后装柱。装柱时最好一气呵成。当然平衡柱子也很重要。

8，请问一下亲和层析的操作要点是什么啊

（一）原理亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。此法具有高效、快速、简便等优点。（二）载体的基本要求和选择理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。纤维素的非特异性吸附强。聚丙稀酰胺凝胶是目前的首选优良载体。琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。（三）试剂与配制 1．Sepharose 4B 2．CNBr（剧毒） 3．抗原或抗体 4．1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。 5．0.1Mol/L NaHCO3 6．2Mol/L NaOH 7．0.01Mol/L pH7.4 PBS 0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml 0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml NaCl 32.76g 加水至4 000ml。 8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl缓冲液甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。 9．7Mol/L尿素 10．0.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI） 1Mol/L NaHCO3 100.00ml NaCl 2.93g 加水至500.00ml。（四）实验方法 1．琼脂糖活化 ⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴置于磁力搅拌器上。 ⑵ 在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反应10min。在1min~2min迅速调整pH为8.0～11.0维持10min。 ⑶ 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。2．偶联蛋白 20ml 4B液体相当于一半的固相载体。⑴ 事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体)。⑵ 将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min内，从抽洗到偶联），4℃缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合。3．装柱 ⑴ 选柱：不宜过大，一般以1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml。 ⑵ 装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以1ml/min的速度流出。 ⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗涤至洗出液的OD280＜0.02为止。收集全部的洗脱液，测得的OD280值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量，由此可计算偶联率。4．吸附与解吸附 ⑴按床体积1/10加样，浓度为1％～2%，缓慢加入待纯化的抗体（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280＜0.02为止。 ⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。5．以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷冻和干裂。6．结果判定 ⑴ 对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定。⑵ 将纯度好的各管洗脱液合并，以生理盐水透析，然后浓缩或冻干保存。

9，层析法的主要操作

HPLC培训教程我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：方法项目数量 1985年版 1990年版 1995年版 2000年版 HPLC法鉴别 9 34 150 检查 12 40 160 含量测定 7 60 117 387 鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。 I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。二、HPLC的特点和优点 HPLC有以下特点：高压—压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2以上。高速—流速为0.1~10.0 ml/min。高效—可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。高灵敏度—紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快—通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min内即可完成。分辨率高—可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。灵敏度高—紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。柱子可反复使用—用一根色谱柱可分离不同的化合物。样品量少，容易回收—样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。三、色谱法分类按两相的物理状态可分为：气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC)。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。GC根据固定相不同又可分为气固色谱法(GSC)和气液色谱法(GLC)，其中以GLC应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。LC同样可分为液固色谱法(LSC)和液液色谱法(LLC)。此外还有超临界流体色谱法(SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。按原理分为吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、排阻色谱法(EC，又称分子筛、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色谱法(GPC）和亲和色谱法。(此外还有电泳。) 按操作形式可分为纸色谱法(PC)、薄层色谱法(TLC)、柱色谱法。四、色谱分离原理高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。 1．液固色谱法使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度5~10μm。适用于分离分子量200~1000的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。常用于分离同分异构体。 2．液液色谱法使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平衡过程。涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。正相色谱法采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。反相色谱法一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高～中中～低流动相极性低～中中～高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。 3．离子交换色谱法固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。 4．离子对色谱法又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。 5．排阻色谱法固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。被分离组分在柱中的洗脱原理

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